(一)生化檢測
1、尿液17—羥類固醇(17—OHCS)、17—酮類固醇(17—KS)和孕三醇測定，其中17—KS是反映腎上腺皮質分泌雄激素的重要指標，對本病的診斷價值優于17—OHCS。腎上腺皮質增生癥患者17—KS明顯升高。 全自動生化檢測儀
2、血液17—羥孕酮(17—OHP)、腎素血管緊張素原(PRA)、醛固酮(Aldo)、脫氫異雄酮(DHEA)、脫氧皮質酮(DOC)及睪酮(T)等的測定，17—OHP基礎值升高是21—羥化酶缺乏的特異性指標，它還可用于檢測藥物劑量和療效。
3、血電解質測定：失鹽型可有低鈉、高甲血癥。
4.ACTH1～24興奮試驗 對于經典型21-羥化酶缺陷癥病人，根據臨床表現和基礎17-OHP，一般可以明確診斷。血清17-OHP基礎值不能提供足夠的診斷依據時，有必要進行ACTH1～24興奮試驗。一般而言60min時17-OHP水平在10ng/ml以上考慮非經典型21羥化酶缺陷癥的診斷。每個實驗室都應根據21羥化酶缺陷癥雜合子攜帶者和正常人確定出自己的診斷標準。
對于新生兒。如果根據外生殖器兩性畸形懷疑CAH，ACTH1～24興奮試驗必須推遲到出生24h后進行。如果在出生后馬上取標本則會有較高的假陽性率和假陰性率。
ACTH1～24興奮試驗還有助于鑒別診斷。在其他酶缺陷的CAH病人中17-OHP也會升高，如11β-羥化酶缺陷癥或3β-羥類固醇脫氫酶缺陷癥。為了鑒別各種酶缺陷，最好的方法是在0，60min檢測17-OHP，DOC，皮質醇及11-脫氧皮質醇、17-羥孕烯醇酮、DHEA和雄烯二酮。如果是幼小的嬰兒，采血量是個問題，則可以只在60min時取血。前體物質與產物的比值對鑒別各種酶缺陷尤為有用。如果診斷仍不明確，應該對患者進行試驗性治療，然后在糖皮質激素部分減量或完全終止后再次檢查。
5.失鹽的檢查 PRA(血漿腎素活性)值升高，特別是PRA與24h尿醛固酮比值增加標志著醛固酮合成障礙。在循環血中ACTH，17-0HP和孕酮水平高，但醛固酮水平正常的病人中這些指標也會升高，這樣沒有很好控制的單純男性化病人生化表現會與失鹽型混淆。鹽皮質激素治療可以對這些病人腎上腺抑制，有助于二者的鑒別。理想狀態下，血漿和尿醛固酮水平應該與PRA和鈉平衡相關，從而有助于對臨床類型的準確判斷。在分析腎素水平的意義時，必須注意新生兒正常值高于年齡較大的兒童。
6.用于診斷和監測21-羥化酶缺陷癥的其他激素 其他一些生化診斷實驗可供考慮，但目前很少能廣泛開展。21-脫氧皮質醇能夠檢測出超過90%的CAH攜帶者。雄激素代謝物(3α-雄烷二醇葡萄糖苷酸)的水平在非經典型21-羥化酶缺陷癥病人中升高，與雄烯二酮和睪酮水平高度相關。17-OHP尿中的主要代謝物孕三醇也可用于21-羥化酶缺陷癥的診斷。另外，尿孕三醇葡萄糖苷酸可以用于監測治療效果和是否治療過度。作為酶聯免疫分析或RIA的代替方法，尿類固醇代謝物可以通過GS/MS方法檢測，這種方法可以使CAH和其他類固醇代謝疾病相關指標同時得到檢測。
(二)其他檢查
1、染色體檢查 外生殖器嚴重畸形時，可做染色體核型分析，以鑒別性別。
2、X線檢查 拍攝左手腕張支骨正位片，判斷骨齡，患者骨齡超過年齡。
3、B超或CT檢查 可發現雙側腎上腺增大。
4、基因診斷 采用直接聚合酶鏈反應，寡核苷酸雜交，限制性內酶片段長度多態性和基因訊序列分析可發現相關基因突變或缺失。
5.性染色體檢查女性細胞核染色質為陽性，男性則為陰性，女性染色體計數性染色體為XX，男性則為XY,可確定其真正性別。
6.其他 女性腎上腺皮質增生假兩性畸形者，用尿道鏡檢查尿生殖竇，可見陰道開口于子宮頸，若家族中有21-羥化酶缺乏者，可采用聚合酶鏈式反應(PCR)、羊膜細胞HLA分型和DNA進行分析。
