淋病檢查

實(shí)驗(yàn)室檢查：

　　淋球菌實(shí)驗(yàn)室檢查包括涂片，培養(yǎng)檢查淋球菌、抗原檢測，藥敏試驗(yàn)及PPNG測定，基因診斷。

　　(一)涂片檢查：

　　取患者尿道分泌物或?qū)m頸分泌物，作革蘭氏染色，在多形核白細(xì)胞內(nèi)找到革蘭氏陰性

　　雙球菌。涂片對有大量膿性分泌物的單純淋菌性前尿道炎患者，此法陽性率在90%左右，可以初步診斷。女性宮頸分泌物中雜菌多，敏感性和特異性較差，陽性率僅為50-60%，且有假陽性，因此世界衛(wèi)生組織推薦用培養(yǎng)法檢查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌較少，陽性率低，因此要取前列腺按摩液，以提高檢出率。

　　咽部涂片發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性雙球菌不能診斷淋病，因?yàn)槠渌紊鷮僭谘什渴钦５木骸Ａ硗鈱ΠY狀不典型的涂片陽性應(yīng)作進(jìn)一步檢查。

　　(二)培養(yǎng)檢查：

　　淋球菌培養(yǎng)是診斷的重要佐證，培養(yǎng)法對癥狀很輕或無癥狀的男性、女性病人都是較敏感的方法，只要培養(yǎng)陽性就可確診，在基因診斷問世以前，培養(yǎng)是世界衛(wèi)生組織推薦的篩選淋病的唯一方法。目前國外推薦選擇培養(yǎng)基有改良的Thayer-Martin(TM)培養(yǎng)基和New York City(NYC)培養(yǎng)基。國內(nèi)采用巧克力瓊脂或血瓊脂培養(yǎng)基，均含有抗生素，可選擇地抑制許多其他細(xì)菌生長。在36℃，70%濕度，含5%-10%CO2(燭缸)環(huán)境中培養(yǎng)，24-48小時(shí)觀察結(jié)果。培養(yǎng)后還需進(jìn)行菌落形態(tài)，革蘭氏染色，氧化酶試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)等鑒定。培養(yǎng)陽性率男性80%-95%，女性80-90%。

　　(三)抗原檢測

　　1.固相酶免疫試驗(yàn)(EIA)：可用來檢測臨床標(biāo)本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地區(qū)而又不能作培養(yǎng)或標(biāo)本需長時(shí)間遠(yuǎn)送時(shí)使用，可以在婦女人群中用來診斷淋球菌感染。

　　2.直接免疫熒光試驗(yàn)：通過檢測淋球菌外膜蛋白I的單克隆抗體作直接免

　　疫熒光試驗(yàn)。但目前在男女二性標(biāo)本的敏感不高，特異性差，加之實(shí)驗(yàn)人員的判斷水平，故該實(shí)驗(yàn)尚不能推薦用來診斷淋球菌感染。

　　(四)基因診斷

　　1.淋球菌的基因探針診斷

　　淋球菌的基因探針診斷，所用的探針有：質(zhì)粒DNA探針，染色體基因探針和rRNA基因探針。

　　(1)質(zhì)粒DNA探針

　　① 隱蔽質(zhì)粒DNA探針，淋球菌質(zhì)粒分為三種：接合性質(zhì)粒，分子最大，為36kb DNA; 耐藥性質(zhì)粒包括兩個質(zhì)粒，DNA長分別為5.6kb和7.1kb;隱蔽質(zhì)粒4.2kb。其中隱蔽質(zhì)粒存在于96%的臨床淋球菌分離株中，其它奈瑟菌不含有此質(zhì)粒，故可用它的序列作為特異DNA探針檢測淋球菌。Torres采用核酸雜交技術(shù)檢測淋球菌，所用探針為隱蔽質(zhì)粒。用該探針對134株淋球菌和131株相關(guān)菌株的檢測，有124株淋球菌雜交反應(yīng)陽性，占93%，還可與個別其它的奈瑟菌出現(xiàn)交叉反應(yīng)，對測定探針的敏感性實(shí)驗(yàn)表明可檢出102CFU淋球菌。研究證明隱蔽質(zhì)粒中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色體中(包括不含該質(zhì)粒的菌株)。因此CPPB基因探針具有良好的特異性和敏感性。Torres等用CPPB基因探針檢測了201份臨床標(biāo)本， 采用非放射性地高辛標(biāo)記系統(tǒng)， 其敏感性和特異性分別為95%和98%。

　　② 耐藥性質(zhì)粒DNA探針

　　淋球菌的抗藥質(zhì)粒可分為：

①產(chǎn)青毒素酶淋球菌(PPNG)其β-內(nèi)酰胺酶陽性;

②具有高水平的質(zhì)粒介導(dǎo)的耐四環(huán)素淋球菌(TRNG)。

　　PPNG菌株是1976年首次在實(shí)驗(yàn)室分離得到的，該菌中含有編碼產(chǎn)青毒酶的基因，該基因既可整合于染色體上也可出現(xiàn)在質(zhì)粒DNA中，而后者居多，稱之為產(chǎn)青毒素酶質(zhì)粒，質(zhì)粒有二種，大小分別為7.4kb和5.3kb。Pescador1998年設(shè)計(jì)一特異的檢測淋球菌編碼β-內(nèi)酰胺酶基因的探針，采用酶化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記，液相雜交，用測光計(jì)測是特異雜交體的光量。在4h內(nèi)可檢測104-105CFU的PPNG菌株。TRNG菌株雖對四環(huán)素耐藥，但通常對β-內(nèi)酰胺酶類及喹諾酮類抗菌素敏感。因此，在實(shí)驗(yàn)室藥敏檢測中可歸為敏感細(xì)菌。Pescador用抗四環(huán)素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探針，該基因介導(dǎo)抗四環(huán)素，用酶化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，液相雜交，4h內(nèi)可直接從臨床標(biāo)本中檢出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。

　　(2)染色體探針

　　染色體探針包括已知功能的基因探針，如菌毛DNA探針和paI基因探針，這些基因在淋球菌感染人細(xì)胞的過程中起著重要作用;未知功能的基因探針，這些探針序列與染色體的特定序列互補(bǔ)，但目前還不知這些基因序列的功能。以上兩種染色體探針由于在淋球菌中互補(bǔ)序列的拷貝數(shù)較低，檢測靈敏度較低，因此一般用的不多，除非有特殊的研究目的。

　　(3)rRNA基因探針

　　rRNA基因探針是將與rRNA互補(bǔ)的DNA作為探針，該探針的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探針的特點(diǎn)是：

①可以增加探針檢測的靈敏度，rRNA基因探針可同時(shí)檢測rRNA分子和DNA分子;

②rRNA具有進(jìn)化上的保守性;

③雜交方法簡便、快速;

④由于rRNA的含量較高，標(biāo)本不需增菌。美國Gen-Probe公司生產(chǎn)的淋球菌檢測探針PACE C，是以rRNA 及其基因?yàn)闄z測靶序列，采用放射性標(biāo)記，在2h內(nèi)可以完成檢測，Peter用這種探針檢測395個臨床標(biāo)本，結(jié)果靈敏度和特異性分別為92.9%，99.4%，他認(rèn)為PACE C系統(tǒng)篩查臨床標(biāo)本中淋球菌是一個可靠的方法。該探針還可以檢測無癥狀淋球菌感染者，這是目前培養(yǎng)難于達(dá)到的。

　　2、淋球菌的基因擴(kuò)增檢測

　　上面講述的探針技術(shù)檢測淋球菌的方法，雖然比培養(yǎng)方法在靈敏度，特異性和方便性上有了很大的提高，但其仍有一定的局限性，如多數(shù)情況下需要標(biāo)本的淋球菌濃度很高，PCR技術(shù)和連接酶鏈反應(yīng)的出現(xiàn)進(jìn)一步提高了檢測淋球菌的靈敏性，它具有快速、靈敏、特異、簡便的優(yōu)點(diǎn)，可以直接檢測臨床標(biāo)本中極微量的病原體。

　　(1)淋球菌DNA的提取

　　①培養(yǎng)菌的DNA提取

　　將培養(yǎng)得到的淋球菌，以102cfu/ml的濃度溶于堿性裂解液中裂解，裂解液組成為：1M NaCl 1M NaOH和1%Sodium dodecyl sulphate。將裂解液混勻后煮沸1min，然后用100mol/L的1M Tris pH7.0中和堿性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次，酚—氯仿抽提一次，然后用無水乙醇或異丙醇沉淀DNA，提取的DNA溶于30mol/L蒸餾水或TE緩沖液中。

　　②臨床棉拭子標(biāo)本的提取

　　將貼有分泌物的棉拭子在2ml的無菌生理鹽水中或PBS緩沖液中擠壓洗1min，以便將標(biāo)本盡量溶于溶液中，將棉拭子棄去，懸浮液于2-3000r/min離心5min，吸去上清液，細(xì)胞重新溶于100mol/L 1x PCR緩沖液，其中含Tween 20 0.45%，蛋白酶K 200μg/ml，細(xì)胞懸浮液于50-60℃溫浴1h，然后95℃加熱10min以滅活蛋白酶K，12000 r/min離心10min，上清液含DNA模板。

　　(2)PCR引物的設(shè)計(jì)

　　由于淋球菌隱蔽質(zhì)粒CPPB基因在淋球菌染色體中和4.2kb隱蔽質(zhì)粒中都有存在，同時(shí)在96%的淋球菌中都有該隱蔽質(zhì)粒，因此很多PCR引物設(shè)計(jì)在CPPB基因區(qū)。

　　靶基因 引物序列 片段長度(bp)

　　CPPB NG1 5′GTT TGG CTG GTT GAT TCA AG 3′ 633

　　NG2 5′GCA AGA TTT CCG ATTT GGC G 3′

　　CPPB HO1 5′GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3′ 390

　　HO2 5′CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3′

　　rRNA 引物1 5′-AGG CTG TTG CCA ATA TCG GC-3′ 206

　　引物2 5′-ACA CTC GAG TCA CCC AGT TC-3′

　　CPPB GC1 5′CTT ATC GTT TGG CTG GTT GAT TC 3′ 435

　　GC2 5′ACC AAG ACC AAA GGT TTG ACA CTG 3′

　　GC3 5′ATT TTC CAG TGT CAA AC 3′ 241

　　GC4 5′TAT TCA AGC CCT ATC TG 3′

　　(3)PCR擴(kuò)增

　　取淋球菌DNA提取液2μl，加入28μl的反應(yīng)液中，最終PCR反應(yīng)液中含dNTP各100μmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2 1.5mmol/L，加無菌石蠟油30μl，1000r/min離心30s，進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)，反應(yīng)條件：94℃變性1min，然后94℃ 30s，57℃1min，72℃1min。共30個循環(huán)，最后72℃延伸5min。

　　擴(kuò)增產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠電泳30min，溴化乙錠染色，紫外燈下可見擴(kuò)增的DNA熒光條帶，分子大小應(yīng)與所用引物擴(kuò)增靶序列的大小一致。

　　(4)PCR的靈敏性和特異性

　　由于CPPB在不含有隱蔽質(zhì)粒的淋球菌染色體上也會含有CPPB基因，再加96%的淋球菌都會有隱蔽質(zhì)粒，因此用CPPB作為靶序列的引物具有極高的敏靈性，實(shí)驗(yàn)證明，一般傳統(tǒng)一步PCR(GC1-GC2)方法可以檢出3個淋球菌，而用單管巢式PCR(GC2-GC4)可以檢出≤0.3淋球菌(9個CPPB基因)。這些引物經(jīng)特異性實(shí)驗(yàn)，只能擴(kuò)增淋球菌的DNA，而對非淋球菌奈瑟氏菌擴(kuò)增不出特異產(chǎn)物。

　　(5)單管巢式PCR方法

　　是在傳統(tǒng)巢式PCR的基礎(chǔ)上將兩對PCR引物作特殊的設(shè)計(jì)，巢式外側(cè)兩個引物(GC1，GC2)為25b退火溫度比較高(68℃)，巢式內(nèi)側(cè)兩個引物GC3-GC4為17b退火溫度較低(46℃)，PCR反應(yīng)液的其它成分與一般PCR相同。這樣，通過控制退火溫度(68℃)使外側(cè)引物先行擴(kuò)增，經(jīng)過20-30次循環(huán)后(第一次PCR)，再降低退火溫度(46℃)使內(nèi)側(cè)引物以第一次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行巢式擴(kuò)增，該P(yáng)CR的靈敏度可達(dá)到檢出0.3個淋球菌。

　　(6)淋球菌連接酶鏈反應(yīng)(LCP)檢測方法

　　目前PCR檢測淋球菌的方法被廣泛地使用。其特異性，靈敏性不斷提高。同時(shí)另一種基因診斷技術(shù)——連接酶鏈反應(yīng)(LCP)也以其高特異，高靈敏性被應(yīng)用于淋球菌的檢測中。LCP 與PCR不同之處在于LCP 用四對引物，所用酶是連接酶。連接酶可以將兩條相鄰引物連接起來。連接起來的兩條引物可以作為另兩條引物的模板，后者在連接酶作用下連接，又可作為模板，如此進(jìn)行30-40次循環(huán)。LCP所用的模板處理方法與PCR模板制備相等。LCP所用的探針除了可以設(shè)計(jì)在CPPB基因上，也可以設(shè)計(jì)在染色體基因序列上，例如opa-1基因。美國Abbott實(shí)驗(yàn)室在opa-1基因的48bp長的區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)了4個LCP探針，由于opa-1基因在淋球菌的染色體中有11次重復(fù)。因此，該組LCP探針具有高靈敏性和特異性。LCP反應(yīng)過程：

　　將模板加入LCP反應(yīng)液中，LCP反應(yīng)液：20mmol/L Tris-HCl pH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2;1 mmol/L EDTA; 10 mmol/L NAD ;10 mmol/L DTT，有標(biāo)記物的兩個相鄰探針各40fmol/L，未標(biāo)記的探針各40fmol/L，15U耐熱連接酶，反應(yīng)條件：97℃1s，55℃1s，62℃50s，其40循環(huán)。100μl反應(yīng)產(chǎn)物加入酶標(biāo)板微孔中，進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后用酶標(biāo)儀讀取光值。根據(jù)Buimer的實(shí)驗(yàn)證明，LCP在檢測男性尿道棉拭子標(biāo)本的靈敏度為100%，尿液標(biāo)本為88.9%，女性宮頸棉拭子標(biāo)本為95.4%。LCP方法的特異性高達(dá)100%，這一點(diǎn)明顯高于PCR的特異性，避免了假陽性的發(fā)生。

　　3. 臨床基因診斷淋球菌的注意事項(xiàng)

　　目前臨床檢測淋球菌的基因診斷方法主要采用PCR方法，但是該方法在臨床檢測中應(yīng)注意幾個問題。

　　(1)引物設(shè)計(jì) 除了以上所列的淋球菌PCR引物外，還可從在其它基因上設(shè)計(jì)，但

　　是引物序列應(yīng)具有特異性。因?yàn)榧?xì)菌的染色體較大，許多基因序列并沒有搞清楚;同時(shí)細(xì)菌之間或近或遠(yuǎn)有一定的同源性，而且細(xì)菌所含質(zhì)粒序列間也存在同源性，因此設(shè)計(jì)引物一定要進(jìn)行基因數(shù)據(jù)庫比較分析，同時(shí)進(jìn)行特異性和靈敏性實(shí)驗(yàn)，從中選擇引物進(jìn)行臨床檢測。

　　(2)臨床標(biāo)本處理 對臨床標(biāo)本來講，PCR模板要求越純越好。這就要求在采集標(biāo)本時(shí)要取到準(zhǔn)確的位置，對于無癥狀患者要適當(dāng)多采樣，以保證采集到病原體細(xì)菌。另外由于臨床標(biāo)本成分比較復(fù)雜，有時(shí)簡單處理的標(biāo)本PCR擴(kuò)增效果并不理想，這可能是由于雜質(zhì)過多造成的，需要進(jìn)一步純化，如用酚一氯仿抽提法純化，結(jié)果將會好轉(zhuǎn)。這種純化方法比較麻煩，目前已有商品化的DNA純化試劑盒，可以較簡便地從臨床標(biāo)本中提取高純度的DNA。

　　(3)PCR產(chǎn)物的檢測方法 不久以前臨床PCR檢測淋球菌幾乎都采用電泳的方法進(jìn)行PCR產(chǎn)物的鑒定。該方法存在許多問題，如由于肉眼觀察的主觀性而造成假陽性和假陰性的結(jié)果。目前用雜交顯色法代替電泳法，提高了結(jié)果判斷的特異性和靈敏性。

　　總之，PCR方法與LCP方法比傳統(tǒng)的培養(yǎng)法在靈敏性和特異性上有了很大的提高，時(shí)間也大大縮短。隨著基因診斷技術(shù)的不斷改進(jìn)。PCR方法與LCP方法在淋球菌的檢測將會成為常規(guī)的檢測方法。

　　(五)藥敏試驗(yàn)：

在培養(yǎng)陽性后進(jìn)一步作藥敏試驗(yàn)。用紙片擴(kuò)散法做敏感試驗(yàn)，或用瓊脂平皿稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)，用以指導(dǎo)選用抗生素。

　　(六)PPNG檢測：

β-內(nèi)酰胺酶，用紙片酸度定量法，使用Whatman I號濾紙PP-NG

　　菌株能使其顏色由藍(lán)變黃，陽性為PPNG，陰性為N-PPNG。