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IVD企業必爭之地“分子POCT”這是你知道的POCT嗎?

POCT(Point-of-care Testing),又稱為即時檢測,其定義為在采樣現場進行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到檢測結果的一種檢測方式。1995年POCT概念首次提出,POCT的出現能夠在快速取得檢測結果的同時免去了樣本的處理和數據分析等繁瑣的步驟,也不必再依賴于專業人員的操作,因此POCT 在醫療中的應用迅速增加,小至自我測試和門診,大至重癥監護病房,POCT 已應用在了各種醫療場合中。

世界衛生組織(World Health Organization,WHO)要求新建立的 POCT 方法應符合“ASSURED”標準,即經濟實惠(Affordable)、靈敏度高(Sensitive)、特異性好(Specific)、操作簡單(User-friendly)、快速并可重復(Rapid and Robust)、無需儀器(Equipment-free)和易獲取(Delivered (to the end user))。該標準首次提出于 WHO 的熱帶疾病研究和培訓特別項目(WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases),同時POCT 應在實驗室和醫院外由非實驗室人員進行。

目前,POCT 不僅可用于血糖檢測和早期妊娠的檢測,還可用于心血管疾病、急慢性腎病、酸堿紊亂、感染性疾病、血液病、凝血功能障礙等方面的檢測。常用的POCT技術早期主要以定性檢測為主,包括膠體金、免疫層析、干化學技術等。后期隨著技術的發展以及對檢測結果需求的逐步提升,以免疫熒光、上轉發光、化學發光、微流控技術等為核心的POCT產品快速發展并逐步應用于臨床,實現了快速的定量檢測,提高了準確性。

核酸分子檢測方法??

核酸分子檢測相對于抗原抗體檢測在準確性、靈敏度、特異性方面具有明顯優勢。一場新冠疫情更是凸顯了其在傳染性疾病防控方面發揮著不可替代的作用。除了PCR之外,常見的核酸檢測方式還有以下幾種:

1、依賴核酸序列的擴增NASBA

1991年Jean Compton首次提出NASBA,該方法以單鏈RNA為模板,在41℃恒溫條件下,通過逆轉錄酶、RNase H和T7 RNA聚合酶以及正向引物和反向引物來模擬體內逆轉錄病的的復制機制進行目標RNA的擴增。90分鐘內可以獲得10的12次方倍產物,其產物長度在100到250個堿基,靈敏度最高達單個拷貝。

2、滾環擴增RCA

RCA是一種在37℃下進行的恒溫擴增反應,具體過程為一條鎖式探針與靶序列雜交后其在連接酶作用下連接成環,引物與環狀模板匹配后在Phi29 噬菌體DNA聚合酶作用下沿環延伸并不停置換先前產生的互補序列,最終產生重復的長單鏈DNA。1小時內其單一引物可產生1000倍放大效果。在此基礎上通過在產物上引入一至多條引物形成超支化RCA、將產物經限制性內切酶切割后再連接成環作為RCA模板、將產物重復片段切開后作為新的引物引發RCA擴增等手段均可實現RCA產物指數級的擴增。

3、環介導等溫擴增LAMP

LAMP由Tsugunori Notomi等人于2000年首次發表,針對模板六個特異性區域設計的一對外引物F3、B3和一對內引物FIP、BIP在具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst ,LavaLAMP等)作用下沿模板發生延伸和置換的循環。在60~65℃條件下1小時內可以獲得10的9次方倍的擴增產物,靶序列的最佳長度在130-200 bp,最佳靈敏度大于10拷貝。在此基礎上,可以通過額外引入一對環狀引物可顯著提升其檢測靈敏度并加速反應進程將時間縮短至30分鐘內。可通過雙鏈嵌合染料對其產物進行實時檢測,經終點法瓊脂糖凝膠電泳對其產物進行檢測時其電泳條帶呈梯形。后來又陸續開發出了多種LAMP檢測方法如比濁法、鈣黃綠素法、羥基萘酚藍、pH響應顯色、側流層析等。

4、解旋酶依賴性擴增HDA

在體內,DNA通過解旋酶、DNA聚合酶及各種輔助蛋白因子進行復制,Vincent等人模仿這一過程開發出了體外的解旋酶依賴性擴增法。該方法原理,首先DNA雙鏈被DNA解旋酶(E. coli UvrD helicase)分離為單鏈并分別被單鏈結合蛋白(SSB)結合,之后兩條上下游特異性引物分別與模板雜交,在DNA聚合酶(exo- Klenow)的作用下延伸,合成新的雙鏈。在37℃條件下反應1-2小時可獲得10的6次方倍的擴增產物,其靶序列在400 bp范圍內可以得到有效擴增。后來有研究稱可以將UvrD解旋酶與Bst-DNA聚合酶偶聯構成一種雙功能蛋白,可顯著提升HDA反應速率,并可實現長達2.3kb的片段擴增。

5、重組酶聚合酶反應RPA

2006年Piepenburg等人首次介紹了RPA反應,目前該方法已有成熟商業化試劑盒推出市場。基礎的RPA反應主要有三種酶參與,包括重組酶(T4 uvsX)、聚合酶(Bsu)和單鏈結合蛋白(gp32)以及兩條特異性的上下游引物。具體擴增機理如下,首先T4 uvsX在輔助因子uvsY的作用下與引物結合形成核酸蛋白復合物,之后該復合物尋找與靶標DNA的互補區域進行雜交并置換下另一條單鏈,該單鏈馬上被gp32結合防止其再與互補鏈雜交。接下來與引物結合的T4 uvsX在ATP的作用下解離,引物在聚合酶Bsu作用下沿模板鏈延伸。該反應在37-42℃下反應,30分鐘內可以獲得10的12次方倍拷貝的擴增產物。其擴增長度在500bp以內最佳。

平臺類型??

標準分子生物學實驗室具有嚴格的功能分區,包括核酸提取區、試劑準備區、擴增區及產物分析區,qPCR的發展應用可使擴增區與產物分析區合并,但仍然需要較大的實驗室空間,而且對實驗室的通風條件、負壓條件及樣本與人員流動方向都具有一定的要求。除了實驗室條件外,分子實驗的操作及結果的判讀分析也具有一定的專業性,需要投入較大人力。使得常規的分子生物實驗室的設立具有較高門檻,難以在各級診療機構全面開展。面對各級醫療機構對于核酸檢測的需求甚至個人自測的需求,各式的核酸檢測POCT產品應運而生。受最適的應用場景、檢測通量、檢測成本的影響,不同廠家在開發分子POCT平臺時具有不同的側重點,因此所呈現的最終的產品形態也是百花齊放。

1、無儀器分子POCT

如Lucira Health新冠試劑中的檢測單元組件包含多個反應腔室,可檢測新冠N基因的兩個非重疊區域,同時設置有一個陽性內部質控(Positive Internal Control, PIC)和一個裂解內部質控(Lysis Internal Control, LIC)。采集樣本后的拭子在樣本管洗脫液作用下,于室溫裂解釋放核酸;核酸進入檢測單元的不同反應腔室,執行RT-LAMP反應;反應過程會導致體系pH值改變,并可通過顯色劑呈現出顏色變化;檢測單元內置的光電元件實時檢測反應體系的顏色變化,從而對檢測結果進行判讀;由于反應過程是實時檢測的,陽性結果可在11分鐘內顯示、陰性或無效結果則需在30分鐘后顯示。

2、微流控分子POCT

博奧將微流控技術與恒溫擴增技術完美結合,滿足當前臨床診斷、食品安全等快檢領域高通量、經濟、高效的需求。最快 20 分鐘即出結果,與 PCR 多孔板擴增相比,反應體系小,操作更簡便,靈敏度可達10-1000拷貝。

3、自動化分子POCT

Automolec 3000,不僅把核酸提取、純化、擴增、檢測集成到了一臺機器上,還做到了“樣本隨來隨檢”。突破了以前高通量一體機只能按批量檢測的限制, 單個樣本隨來隨檢,首個結果100分鐘,之后2分鐘出一個結果,可實現200測試/8小時,多項目同時載機測試,適用多樣本類型。

分子POCT上游組件??

為實現上述各種形態的POCT產品,需要依托完整的工業體系,包括電子信息、機械工程、微流體通路設計、光學設計等,此外還有材料、化學、生物等的支持。

液路模塊是分子POCT產品最具挑戰的核心技術之一,常見的有管式、卡盒式、盤式、以及微流控芯片式。其中微流控芯片更是對當前最先進工藝的整合,其基質從無機材料到有機材料均有覆蓋。而不同材料所制備的芯片往往適用于不同功能的生化分析需求。同時,不同材質在加工方面的難易程度也成為人 們選擇芯片基質的一個重要原因。最初的微流控芯片基質是半導體行業中所常用的硅片,可通過干法刻蝕或濕法刻蝕進行加工成型,在硅片表面形成不同的通 道與分區來實現不同功能。雖然硅片不具透光性,導致多數基于光學的生化分析或熒光成像檢測難以應用于硅質芯片,但是可通過在芯片特定結構部分添加金屬相來進行電化學檢測,或者與透明材質如玻璃的混用來解決光學檢測的問題。

由于玻璃具有良好的光透過性,具有很低的熒光背景,而且可通過硅羥基在玻璃表面輕易進行多種修飾改性,因此玻璃逐漸替代硅成為主要的無機硬質微流控芯片材質,同樣可采用濕法刻蝕或干法刻蝕進行微結構的加工。但是無論是以硅還是玻璃作為芯片的基質,其加工制作工藝難度相對較大,需要大型儀器設備,成本較高,并不利于一次性檢測芯片的推廣應用,而且開發準入門檻較高,也限制了其發展。因此更多的實驗室將芯片的研發聚焦于有機材料如 PDMS,此類材料借助陽模可直接注塑成型,能夠顯著降低單個樣本的檢測成本。

生物制劑則是液路系統之外另一核心技術。不同于常規分子診斷試劑,為了適配POCT的需求,反應所需的生物酶、dNTP、鹽離子緩沖介質等往往需要預載到卡盒或芯片的個功能腔室內,而預載試劑的卡盒由于具有較大體積,且受卡盒基質、預載試劑的多樣性如磁珠等特性的影響,以及儲存運輸成本的限制,一般需要進行4℃或常溫存放,這就對試劑的穩定性和耐熱性提出了嚴格要求。

藥品資訊

  • 氣管炎的癥狀可以通過使用一些藥物來緩解,例如抗生素、解熱鎮痛藥、止咳藥和抗炎藥等。具體使用哪種藥物,需要根據患者的具體癥狀和醫生的診斷來決定。針對氣管炎的癥狀,患者可能會感到咳嗽、喉嚨痛、發熱和呼吸困

  • 頸椎椎管狹窄可能導致的癥狀包括頸部疼痛、肩背部疼痛、手臂麻木或刺痛感、手指無力、精細動作困難、步態不穩以及偶爾的排尿或排便障礙。這些癥狀可能在頸部活動或長時間保持同一姿勢后加劇。頸椎椎管狹窄的癥狀分析

  • 風毒的癥狀

    2025-07-02

    風毒的癥狀通常表現為皮膚紅腫、瘙癢、疼痛,有時還伴有發熱、關節疼痛和肌肉酸痛。這些癥狀可能因為個體差異和風毒的嚴重程度而有所不同。風毒的癥狀分析顯示,皮膚紅腫和瘙癢是由于風毒引起的局部血液循環障礙和炎

  • 腎衰竭的癥狀包括尿量減少、水腫、疲勞、惡心、嘔吐、食欲不振、皮膚瘙癢、貧血、高血壓、口中有尿味等。這些癥狀的出現可能與腎臟功能下降,無法有效清除體內廢物和多余水分有關,導致毒素在體內積累,影響多個器官

  • 尿酸高痛風的癥狀主要包括劇烈的關節疼痛、紅腫、發熱和觸痛,尤其是在夜間或清晨時更為明顯。患者可能會感到關節僵硬,活動受限,嚴重時甚至可能影響日常活動。此外,尿酸高還可能導致腎結石和腎功能受損。針對尿酸

  • 神經有問題時,可能會出現多種癥狀,包括但不限于頭痛、記憶力減退、情緒波動、睡眠障礙、肌肉無力或抽搐、感覺異常如麻木或刺痛、協調能力下降以及言語障礙等。這些癥狀可能因個體差異和神經問題的具體類型而異,嚴

  • 胸椎腫瘤的癥狀可能包括背部疼痛、肌肉無力、感覺異常、活動受限和神經根壓迫引起的放射痛。這些癥狀可能隨著腫瘤的生長而逐漸加重,影響患者的日常生活和活動能力。分析這些癥狀,背部疼痛通常是首發癥狀,可能在活

  • 老慢支的癥狀

    2025-07-02

    老慢支,即慢性支氣管炎,是一種常見的呼吸道疾病,其癥狀主要表現為咳嗽、咳痰、氣短和喘息。患者可能在早晨起床時咳嗽較為明顯,咳出的痰液多呈白色黏稠狀,有時可能帶有黃色。隨著病情的發展,患者可能會感到呼吸

  • 懷孕40天時,許多女性可能會開始經歷一些早期妊娠癥狀,包括乳房脹痛、輕微出血、疲勞、惡心和嘔吐。這些癥狀并不在所有孕婦中都會出現,且程度和時間也因人而異。在懷孕初期,由于體內激素水平的變化,乳房可能會

  • 腹腔腫瘤的癥狀可能包括腹痛、腹部腫塊、消化不良、惡心嘔吐、體重下降、食欲減退、便秘或腹瀉等。這些癥狀可能因腫瘤的大小、位置和生長速度而異,有時可能并不明顯,導致診斷延遲。針對這些癥狀,重要的是要提高警

  • 尿道息肉是一種生長在尿道內的良性腫瘤,其癥狀可能包括尿道出血、排尿困難、尿頻、尿急和尿痛。這些癥狀可能隨著息肉的大小和位置而有所變化,小的息肉可能不會引起任何不適,而較大的息肉則可能導致明顯的不適和并

  • 宿醉的癥狀

    2025-07-02

    宿醉的癥狀主要包括頭痛、惡心、口渴、疲勞、胃部不適、情緒波動和認知功能下降等。這些癥狀通常在過量飲酒后出現,可能持續數小時甚至一整天。宿醉的癥狀是由酒精代謝過程中產生的乙醛引起的,乙醛是一種有毒物質,

  • 瘰疬的癥狀

    2025-07-02

    瘰疬是一種慢性感染性疾病,主要表現為頸部淋巴結腫大,這些腫大的淋巴結可能單個或多個,質地較硬,大小不一,且表面光滑。患者可能伴有疼痛或壓痛,嚴重時淋巴結可能破潰形成竇道,排出膿液。瘰疬的癥狀還包括發熱

  • 嬰兒氣管炎的癥狀包括咳嗽、喘息、呼吸急促、發熱以及胸部發出異常聲音。這些癥狀可能在嬰兒活動或哭鬧時加劇,而在安靜時減輕。由于嬰兒的免疫系統尚未完全發育,他們更容易受到病毒或細菌的感染,從而導致氣管炎。

  • 肺腎氣虛的癥狀主要包括呼吸短促、氣喘、乏力、腰膝酸軟、頭暈耳鳴、尿頻或夜尿增多等。這些癥狀的出現,往往與肺和腎的功能減弱有關,肺主氣,腎藏精,兩者相互影響,共同維持人體的呼吸和生殖功能。針對肺腎氣虛的

  • 腎虛耳鳴的癥狀主要表現為聽力下降、耳內嗡嗡聲或蟬鳴聲,這些癥狀可能伴隨頭暈、腰膝酸軟、記憶力減退等。耳鳴的聲音可能在安靜時更為明顯,影響睡眠質量,甚至導致情緒波動。分析這些癥狀,我們可以發現它們與中醫

  • 中度抑郁癥的癥狀包括持續的情緒低落、興趣或愉悅感減退、睡眠障礙(如失眠或過度睡眠)、食欲改變(增加或減少)、疲勞感、注意力難以集中、自我價值感下降、以及反復出現死亡或自殺的念頭。這些癥狀可能會對個體的

  • 肝出血的癥狀

    2025-07-02

    肝出血的癥狀可能包括腹部疼痛、腫脹、惡心、嘔吐、腹瀉、發熱和黃疸。這些癥狀可能伴隨血壓下降、心跳加快等休克跡象。在嚴重情況下,患者可能會出現意識模糊或昏迷。肝出血可能由多種原因引起,如肝硬化、肝癌、肝

  • 深靜脈血栓的癥狀可能包括腫脹、疼痛、皮膚發紅或變色、局部溫度升高以及靜脈區域的觸痛。這些癥狀可能在單側肢體出現,尤其是腿部。患者可能會感到腿部沉重或疼痛,尤其是在長時間站立或坐著后。有時,深靜脈血栓可

  • 腎發炎的癥狀

    2025-07-02

    腎發炎,也稱為腎盂腎炎,是一種腎臟感染,其癥狀可能包括尿頻、尿急、尿痛、腰痛、發熱和寒戰。患者可能會感到一側或兩側腰部疼痛,尤其是在排尿時。尿液可能呈現渾濁或帶血。此外,患者可能會出現惡心、嘔吐、疲勞

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